Reduced Representation Bisulfite Sequencing(RRBS)是一种准确、高效、经济的DNA甲基化研究方法。该方法前期用MspI酶切,该酶的酶切位点为CCGG,从而将CpG位点富集出来,之后再进行bisulfite处理实现C与mC的单碱基区分,最终用较小的数据量得到包含最多CpG位点甲基化信息的单碱基精度的甲基化图谱。该方法的覆盖范围具有良好的重复性和稳定性;并且能通过酶切位点过滤部分降解片段对结果的影响。但是RRBS的覆盖范围被酶切位点所限制,只能覆盖基因组的部分区域,主要集中在promoter 和CpG island 等富含CpG 的区域。在疾病研究中,Promoter 的甲基化状态与基因表达、性状表型息息相关,RRBS 作为一种关注CpG-rich 区域的甲基化研究方法,能够避免过多的数据浪费,更有针对性的研究覆盖区域的甲基化状态,使得大样本量单碱基分辨率的甲基化差异研究成为可能。
应用新一代甲基化测序技术RRBS鉴定肥胖患者的基因变化
Next-generation sequencing methylation profiling of subjects with obesity identifies novel gene changes
肥胖是一种由环境和遗传因素引起的代谢疾病。但是,肥胖的表观机制并不是很清楚。该研究的目的是探索骨骼肌DNA甲基化和转录变化在肥胖中的作用。
本研究主要结果如下:
1.对参与研究的12名正常体型的(BMI=23.4±0.7kg/m2)和10名肥胖的(BMI=32.9±0.7kg/m2)志愿者进行基础的肌肉活检和胰岛素检查来检测胰岛素的敏感性。对经过活检的股外肌的DNA和RNA进行RRBS测序和芯片分析。鉴定出13,130个肥胖正常之间,在启动子和5'UTR,3'UTR位置处差异甲基化胞嘧啶(DMC; uncorrected P < 0.05)。
2.芯片分析显示99个基因表达显著性改变(corrected P < 0.05)。其中12个基因,围绕22个甲基化位点,显示出基因甲基化水平和基因表达水平的负相关。
3.一个编码人重组蛋白手提的基因SORBS3在肥胖患者中表达显著增高,有9个差异甲基化胞嘧啶甲基化水平显著上升(5.0-24.4%的甲基化差异)。
4.差异甲基化区域分析鉴定出SORBS3的5'UTR区域(Chr.8:22,423,530–22,423,569)在肥胖组中甲基化水平上升了11.2%。
5.位点特异测序和qRT-PCR验证了SORBS3的DNA甲基化水平和表达水平负相关。
6.通过转录因子结合位点分析鉴定出一些和肥胖相关的可以结合到差异甲基化位点的转录因子。
结论: 肥胖通过DNA甲基化调控转录组变化,骨骼肌中SORBS3的表达与肥胖相关。
部分结果展示:
1)甲基化位点分析。利用RRBS鉴定出了2,586,085个甲基化位点。大部分的甲基化位点位于基因间区,且启动子区域与5'UTR区的CpGs岛屿有明显的重叠。
图1. 甲基化位点分布特征
2)启动子、3'UTR、5'UTR区域的基因表达和甲基化差异联合分析。RRBS数据分析发现,在启动子区域,3'和5'UTR区共鉴定出710,981个甲基化位点,其中甲基化差异显著的位点(DMCs)共13,130个;microarray分析发现有99个基因差异表达显著。其中有12个包含有22个差异甲基化位点的基因的表达水平与甲基水平呈负相关关系。
图2. 差异甲基化位点和基因差异转录的联合分析
Day, S.E., et al., Next-generation sequencing methylation profiling of subjects with obesity identifies novel gene changes. Clin Epigenetics, 2016. 8: p. 77.